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细小病毒抗体检测试剂盒(酶联免疫法)检测原理【预期用途】 猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)引起的猪的繁殖障碍性疾病,其特征为受感染的母猪,特别是初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪,而母猪本身无明显症状。 本试剂用于检测猪血清中猪细小病毒抗体,可用于猪细小病毒疫苗免疫效果评价。 【原 理】 本试剂盒由预包被猪细小病毒抗原的酶标板、酶标记物及其他配套试剂组成,应用酶联免疫法(ELISA)原理检测猪血清、血浆样本中猪细小病毒抗体。实验时在酶标板中加入对照血清和待检样本,经温育后若样品中含有猪细小病毒抗体,则将与酶标板上抗原结合,经洗涤除去未结合的其他成分后;再加入酶标记物,与酶标板上抗原抗体复合物发生特异性结合;再经洗涤除去未结合的酶标记物,在孔中加TMB底物液,与酶标结合物反应形成蓝色产物,显色深浅与样品中的特异性抗体含量成正相关;加入终止液终止反应后,产物变为黄色;用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值,即可知样品是否含有猪细小病毒抗体。 【试剂盒组成】
【储存及有效期】 2~8℃保存,有效期12个月。 包被板开封后请于2~8℃避光保存,避免受潮。使用期限为2个月。 【适用仪器】 含450nm、630nm波长的酶标仪,37℃恒温设备,可调微量移液器。 【样品准备】 1.取动物全血按常规方法制备血清,要求血清清亮,无溶血、无污染。样品1周内可于2~8℃保存,长期需置-20℃保存。 2.用样品稀释液将待检血清按40倍稀释(如5μl血清加入195μl样品稀释液中,混匀)。阴、阳性对照不用稀释。 3.浓缩洗涤液使用前应恢复至室温使沉淀溶解,然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释成工作洗涤液(如19份蒸馏水或去离子水+1份浓缩洗涤液)。 【检验方法】 1.使用前将试剂盒置室温30分钟,恢复至室温。 2.取所需用量酶标板条,设空白对照1孔、阴性/阳性对照各2孔,未用的板条尽快密封,2~8℃保存。 3.空白对照孔加样品稀释液100μl;阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照100μl;样品孔每孔加入稀释后的样品100μl。 4.混匀,盖好盖板膜,置37℃(推荐水浴)避光反应30分钟。 5.甩去孔内液体,每孔加350 ul工作洗涤液,静置30秒后弃去,重复洗涤5次,最后一次拍干。 6.每孔加酶标记物100μl(空白孔除外)。盖好盖板膜,置37℃避光反应30分钟。 7.洗涤,同步骤5。 8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl,混匀,盖好盖板膜,置37℃避光反应10分钟。 9.每孔加终止液50μl,混匀,于450nm(可用630nm作参比波长)测定各孔吸光值,无参比波长用空白孔调零(即所有孔吸光值减去空白孔吸光值)。 【参考值】 实验正常的情况下,阴性对照的平均OD值即ODNC应≤0.3,阳性对照的平均OD值即ODPC应≥0.6。 【检验结果的判定】 1.样品的OD值即ODS; 2.阈值计算:SP值=(ODS-ODNC)/(ODPC-ODNC); SP值≥0.2,结果判定为阳性;SP值<0.2,结果判定为阴性。 3.本实验结果为阴性时表明猪只抗体水平不足,建议补打相应疫苗。 【试验方法的局限性】 该试验仅作为定性检测猪血清、血浆中猪细小病毒抗体,根据SP值高低可作抗体水平强、中、弱的粗略评估。 【注意事项】 1.实验操作时需戴手套、穿工作衣,严格健全和执行消毒隔离制度,各种实验废弃物都应按传染物处理。 2.终止液具有腐蚀性,应避免接触皮肤和衣物,如不慎接触请立即用大量自来水冲洗。 3.酶标板从冷藏环境中取出时应恢复至室温方可开袋,未用完的酶标板需放入有干燥剂的密封袋中保存。 4.浓缩洗涤液在低温时容易结晶,使用时需恢复至室温以完全溶解。 5.洗涤时各孔均需加满液体,防止孔口有游离酶不能洗净。 6.用于检测的样品应保持新鲜。 7.试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。 8.不同批号试剂组分不得混用。 |